Білковий розчин

Білковий розчин, який спочатку був заморожений у вигляді плівки на стінці судини, підтримується в замороженому стані завдяки безперервної сублімації водяної пари, які переходять в конденсатор. Швидкість сублімації і переходу вологи повинна бути, таким чином, досить великий для того, щоб тепло відводилося від льоду з такою ж швидкістю, з якою воно надходить з навколишнього посудину простору. З цієї причини шар льоду розподіляють у вигляді плівки, а перетин сполучної трубки роблять досить широким для того, щоб швидкість проходження по трубці парів води не могла бути лімітуючим фактором. За допомогою цього методу можна з успіхом ліофілізований розчини, які містять етиловий спирт в концентраціях принаймні до 25% (об'ємні. Однак більш низькі температура замерзання і теплота випаровування водно-спиртових сумішей роблять кілька скрутним запобігання плавлення білкового розчину в умовах висушування. У всіх випадках, навіть в разі водних розчинів, рекомендується намораживать розчин на стінку судини при температурі, набагато нижчою, ніж температура замерзання розчину. Вакуум повинен встановлюватися швидко, щоб уникнути плавлення під час цього періоду.

Білковий розчин пропускають через гель се - фадекса. Вміст білка в знесоленої фракціях визначають або по оптичної щільності при 280 нм, або в реакції осадження білка трихлороцтової кислотою.

білковий розчин коагулюється водним розчином ово - Бодня кислоти (відміну від ггіро - і ортофосфорної кислот), але не розчинами лужних метафосфатов.

Прядильний білковий розчин містить 20 - 30% білків і 0 5 - 1% NaOH. Питома витрата лугу для отримання прядильного білкового розчину значно менше, ніж при приготуванні віскози. Мінімальний вміст лугу має велике значення не стільки для зниження її витрати, скільки для зменшення деструкції макромолекул білка при приготуванні і підготовці прядильного розчину до формування.

Якщо білкові розчини обертати на ультрацентрифуге з дуже високою швидкістю, так, щоб розвинути відцентрову силу, приблизно в 500000 разів перевищує силу земного тяжіння, то білкові частинки будуть осідати набагато швидше, ніж при застосуванні методу седиментационного рівноваги. Якщо молекулярна маса білкових молекул високий, швидкістю дифузії можна знехтувати, так як зі збільшенням молекулярного ваги розчиненої речовини швидкість осідання зростає, а швидкість дифузії значно зменшується.

Досліджуваний білковий розчин невідомого складу инкубируют зі специфічною імунною сироваткою; утворився преципітат видаляють центрифугуванням, а надосадову рідину в якості виснаженої імунної сироватки використовують при іммуноелектрофорезе відомої суміші білків. В отриманій іммуноелектрофореграмме будуть відсутні саме ті компоненти, які є загальними для досліджуваного білкового розчину і для відомої суміші білків, так як вони видалили з імунної сироватки відповідні антитіла.

Стійкість білкових розчинів також сильно залежить від рН середовища.

Стійкість білкових розчинів сильно залежить від рН середовища. Наявність зарядів на білку в кислої і лужної області від ізоелектричної точки призводить до підвищення гідратації білкових молекул і їх розчинності. У ізоелектричної точці розчинність найменша і в цій точці білкові розчини володіють мінімальної стійкістю. Змінюючи рН розчину білка в різних буферних системах, можна по мінімуму розчинності визначити Ізоелектрична точку білка. У мінімумі розчинності частки білка сильно агрегує, і каламутність розчину підвищується; тому Ізоелектрична точку білків можна визначити по максимуму помутніння.

Краплю білкового розчину поміщають на насичену буферним розчином смужку паперу, а до електродів, поміщеним на кінцях цієї смужки, прикладають різниця потенціалів.

Здатність білкових розчинів збільшувати або зменшувати дисоціацію знаходяться в них солей, характеризується - діелектричної відбулось таких розчинів (D); чим вище полярність молекул, тим більше D; для розчинів неполярних з'єднань величини D низькі. Існує обратнопропорциональная залежність між D і силами електростатичного притягання і відштовхування молекул - зростання D супроводжується стабілізацією молекул, зниження D - їх тяжінням і агрегацією. Нагадаємо, що D для води при 20 С дорівнює - 80 - 82 дл. Зтіловий спирт використовують як фракционируют агента білкових молекул. До того ж він дегідратірующая ці молекули.

У білковому розчині розсіяне світло має велику інтенсивність, ніж в чистому розчиннику.

Додавання в білковий розчин солі викликає часткову зміну третинної і четвертинної структури молекул внаслідок зміни електрокінетичного потенціалу і зменшення ступеня гідратації білкових молекул, що призводить до їх агрегації, ступінь якої різна для різних білків. На цьому принципі, як вказувалося вище, ґрунтується фракціонування біополімерів.

Додавання в білковий розчин іонів кальцію призводить до створення мостічних зв'язків або комплексних сполук за рахунок водневих зв'язків між ланцюгами білкових молекул і тим самим сприяє утворенню розгалужених агрегатів.

Методи концентрування білкових розчинів описані нижче (стор.

Перевіряють рН білкового розчину і, якщо потрібно, доводять його значення до 7 0 СНзСООН або аміаком. На водяній бані (80 С) нагрівають білковий розчин до 60 С, інкубують 5 хв при постійному перемішуванні. Після цього ргствор швидко поміщають в лід і охолоджують до 10 С.

Якщо до білкових розчинів додати солі лужних або лужноземельних металів, то білки випадають в осад - висаліваются. Часто застосовують сульфат амонію, за допомогою якого в певних умовах можна здійснити дробове осадження білків.

Якщо до білкових розчинів додавати надлишок нападників розчинів, то білки денатурируются і кількісно осідають з розчинів.

Кордон між білковим розчином і буфером не є геометричній площиною в строгому сенсі слова; скоріше її можна охарактеризувати як вузьку зону з показником заломлення, що змінюються від показника заломлення білкового розчину в буфері до показника заломлення чистого буферного розчину.

Вивчення осмотичного тиску білкових розчинів застосовується для визначення молекулярної ваги білків і дослідження взаємодії між ними.

Хоча вимірювання в'язкості білкових розчинів не дають безпосередньо знань розміру і форми макромолекули, цей метод є одним з найпростіших прийомів вивчення молекулярних параметрів. За результатами вимірювання в'язкості розчинів еліпсоідальних і стрижневих молекул виявляється можливим обчислити відношення довжини молекул до їх товщині, а для фібрилярних білків визначити і їх абсолютні розміри. З іншого боку, в'язкість розбавлених розчинів білка є функцією їх молекулярного ваги.

Низькомолекулярні речовини з білкового розчину можна видалити досить швидко і повно за допомогою гель-фільтрації. Принцип, що лежить в основі цього методу, вельми простий. Хроматографическую колонку заповнюють гелем набряклим у воді або буферном розчині.

Чому при обессоливании білкового розчину методом гель-фільтрації білок за часом з'являється в елюіруются рідини раніше, ніж іони солі.

Для успішного аналізу білкових розчинів невідомого складу можна застосовувати такі методи: 1) іммуноелектрофорез в тих випадках, коли вдається ідентифікувати смуги преципітації, отримані з імунною сироваткою (фіг. 31А); 2) метод Оссермана в тих випадках, коли дослідник має розчинами референс-білка і відповідної антисироваткою (фіг. Замість того щоб вносити білковий розчин (наприклад, сироватку крові) в заздалегідь вирізану лунку, можна нанести його на відрізок фільтрувального паперу 10 х 3 мм і прикласти папір до поверхні агару у відповідному місці, після чого білковий розчин дифундує в гель. Перевага цього способу полягає в тому, що відпадає необхідність вирізати порушують цілісність електрофореграми лунки. Але, з іншого боку, при цьому способі внесення зразка можна точно визначити кількість білка, продіффундіровавшего в агар.

При насиченні сульфатом амонію білковий розчин ретельно охолоджують в посудині з тающим льодом. Перемішування продовжують 30 хв і знову центрифугують. Супернатант відкидають, осад суспендують в 80% - ном розчині сульфату амонію, що містить 10 мМ 2-меркаптоетанол. Концентрація білка в суспензії становить 20 - 40 мг /мл. На цій стадії фермент може зберігатися при 4 С кілька днів без втрати активності.

Дослідне визначення ізоелектричної точки білкових розчинів, як і визначення ізоелектричного стану ліофоб-них золів, може бути вироблено різними методами-прямими і непрямими.

Діаграми електрофоретичного аналізу по Тізеліус. Експериментальне визначення ізоелектричної точки білкових розчинів, як і визначення ізоелектричного стану ліофобних золів, може бути вироблено прямим або непрямим методами.

При нагріванні і замерзанні білкових розчинів, а також під дією хлористого натрію, спирту та інших речовин білки коагулюють (згортаються), наприклад згортається білок яйця при його варінні, білки молока (казеїн) при підвищеній іонізації повітря під час грози. При коагуляції білки втрачають частину води, що утворює водну оболонку навколо білкової молекули. Цей процес називають дегідратацією.

Кроїть заперечує проти ототожнення білкових розчинів з істинними розчинами і не тому, що розчини білків мають властивості колоїдів, а тому, що вони не володіють властивостями, характерними для істинних розчинів.

Експериментальне визначення ізоелектричної точки білкових розчинів, як і визначення ізоелектричного стану ліофобних золів, може бути вироблено прямим або непрямим методами.

Мікроорганізми необхідно видаляти з білкових розчинів, оскільки вони або змінюють білки, або ускладнюють суміші за рахунок введення додаткових компонентів.

Для знесолення 100 мл білкового розчину необхідно приблизно 25 г сухого сефадексе G-25. Обсяг розчину, з якого потрібно видалити солі, повинен бути не більше однієї п'ятої обсягу гелю, що заповнює колонку.

При високій іонній силі білкового розчину спостерігається конкуренція між білковими молекулами і іонами солі за молекули води. Ступінь гідратації білка знижується, взаємодія білок-білок при цьому стає ефективніше, ніж білок-вода, і білок осідає.

Діаліз білка. дуже зручним методом очищення білкових розчинів від низькомолекулярних домішок, наприклад від надлишку солей після висолювання, є діаліз.

Кроїть заперечує проти ототожнення білкових розчинів з істинними розчинами і не тому, що розчини білків мають властивості колоїдів, а тому, що вони не володіють властивостями, характерними для істинних розчинів.

Європейський зубр. Завдяки в'язкості і густоті білкового розчину крапельки жиру залишаються в молоці в підвішеному стані і утворюють емульсію. Жирові крапельки в цій емульсії лише дуже повільно збираються в верхньому шарі, утворюючи з л і в к п, але не злипаються між собою, так як кожну з них одягає тонкий шар білка.

Схема приладу Тізеліус для електрофоретичного аналізу білків. Припустимо, що ми маємо білковий розчин, в якому є три фракції, що розрізняються між собою електрофоретичний швидкостями і, і і і, причому електрофоретична швидкість і має найбільшу величину, а й найменшу. На схемі рис. 82 ці фракції позначені відповідно чорними і білими кружками. Фракція проміжної швидкості і позначена наполовину зачорненим гуртком. Після видалення надлишку вихідного білка і заповнення верхньої частини трубки буферним розчином (рис. 82 а) прилад встановлюється в початкове положення (рис. 82 б) і включається електричне поле. Напрямок поля таке, що частки білків, що мають однаковий знак заряду, але різну швидкість зсуву, пересуваються зліва направо.

Якщо необхідно провести порівняння двох білкових розчинів або двох сумішей білків, їх вносять у дві верхні лунки (/і //на фіг. Від чого залежить осмотичнийтиск білкових розчинів: а) від числа розчинених молекул; б) від молекулярної маси білка; в) від форми білкової молекули.

Третя пробірка служить для порівняння прозорості білкового розчину до і після додавання солі або лугу.

Метод дисперсії светорассеяния зручний при дослідженні білкових розчинів в разі, коли їх каламутність т обумовлена розсіюванням світла переважно великими частками.

Цілісна кров (суспензія елементів в білковому розчині - плазмі) є неньютоновской рідиною. Її в'язкість тим вище, чим повільніше вона тече. В основному це обумовлено агрегацією еритроцитів. У нерухомій крові еритроцити агрегує, утворюючи так звані монетні стовпчики, при швидкій течії крові агрегати еритроцитів розпадаються, і в'язкість зменшується. На рис. 12.2 показана агрегація еритроцитів при патології крові.

Швидкість денатурації зменшується також, якщо зберігати білковий розчин з низькою температурою. Для отримання препаратів нативних білків необхідно тому мати в лабораторії рефрижератори, центрифуги з охолодженням і холодні кімнати. При низьких температурах зменшується і друга небезпека - можливість бактеріального розкладання білка. Білкові розчини являють собою прекрасну живильне середовище для бактерій і незмінно піддаються, якщо їх зберігати при кімнатній температурі, зараження бактеріями, що руйнують білки.

З викладеного видно, що визначення щільності білкових розчинів не представляє особливих труднощів. Труднощі виникають, однак, при вимірюванні щільності сухих білків або вологих білкових препаратів. Багато білки при висушуванні денатурируются, що унеможливлює використання цих препаратів для дослідження гідратації. Це складне становище можна було б подолати, визначивши попередньо щільність вологих кристалів або розчину білка, а потім вже висушивши білок. Однак при цьому залишається основна складність, пов'язана з визначенням щільності сухого або вологого білка. Один з методів, що застосовуються для цієї мети, полягає в тому, що досліджуваний білок поміщають в пікнометр, зважують його, а потім наповнюють пікнометр рідиною відомої щільності. Зрозуміло, такий заповнює рідиною не може служити вода, так як вода буде збільшувати ступінь гідратації; не можна застосовувати також етанол, ацетон і ефір, так як вони здатні притягувати воду і, отже, будуть зменшувати ступінь гідратації. Зазвичай використовують для цієї мети бензол, бромбензол і інші гідрофобні рідини. Але навіть і при цьому умови отримані результати не цілком задовільні, так як, по-перше, на поверхні розділу вода-розчинник має місце денатурація білка, а по-друге, невелика кількість води все ж розчиняється в цих розчинниках. Крім того, при суспендуючі-вання сухого білка в органічної рідини з'являються маленькі бульбашки повітря, що знижують точність визначення.

Безбілковий розчин того ж буфера обережно нашаровуються на білковий розчин.

Стабілізуючу дію молекули води. Передбачається, що причиною підвищених значень діелектричної проникності білкових розчинів є орієнтація молекул води близько молекули білка так, що виходить структура, схожа на структуру льоду.

Тепер уже очевидно, що для розуміння властивостей білкових розчинів і характерних для них реакції слід звертатися до теорій, що описують поведінку справжніх розчинів.

В результаті виходить рівна, чітка межа між білковим розчином і буфером, зручна для спостереження. Центральна частина приладу заповнюється буферним розчином.



Інші публікації на тему:
  • Пружність - пар - льод
  • Сублімація - твердий
  • Метод - сублімація