Афінний сорбент

Аффінниє сорбенти с]груповий специфічністю в деяких випадках не поступаються по вибірковості сорбентам з індивідуальною специфічністю, а іноді навіть мають свої переваги.

Афінний сорбент з групової специфічністю має явну перевагу в тому випадку, коли ставиться завдання не тільки очищення, але і поділу декількох речовин, наділених спорідненістю до одного і того ж ліганду. Якщо ступінь цього спорідненості не однакова для різних речовин групи або якщо вдається підібрати для них різні (специфічні) конкурентні елюентом, то поділ речовин може бути здійснено хроматографически, в ході їх почергової елюції з сорбенту, що не вдалося б зробити в разі лиганда, що володіє суто індивідуальною специфічністю. З позицій очищення одного речовини це ж стан справ можна сформулювати наступним чином: зниження вибірковості сорбції при використанні сорбентів з групової специфічністю часто вдається компенсувати за рахунок вибірковості аффинной конкурентної елюції.

Аффінниє сорбенти на базі полиакриламида і барвників Phenyl Neutral Red і Malachite Green[Biinemann, Muller, 1978 ]можуть бути використані для фракціонування нуклеїнових кислот і їх фрагментів за процентним вмістом в них ГЦ-пар нуклеотидів. В цьому випадку елюція ведуть лінійними градієнтами концентрації солей. Зокрема, таким чином можна відокремлювати ГЦ-багату сателітну ДНК або Фракціоновані рестріктние фрагменти ДНК фага Я, нуклеотідний складу яких значно змінюється по довжині молекули ДНК.

Афінний сорбент готували, як зазвичай, фіксацією IgG на BrCN-активованої сефарозе. Якщо на такий сорбент посадити суміш фрагментів нуклеїнових кислот, що включає в себе і ДНК-РНК-гібриди, то ступінчаста елюція 1 М NaCl, 3 М і 5 М NaSCN (всі - в фосфатному буфері) видаляє спочатку інші фрагменти, а потім на останньому щаблі - справжні ДНК-РНК-гібридні молекули.

Афінний сорбент А, приготований шляхом прив'язки інгібітора - п-амінофеніл - р - про - тіогалактопіранози - безпосередньо до сефарозе, не пов'язує і не затримує фермент в помітному ступені. Прикріплення інгібітора через коротку ніжку (- 10 А) дає сорбент Б, який дуже мало затримує фермент під час його пропускання через колонку. Для звільнення ферменту з комплексу немає необхідності в зміні складу буферного розчину, і фермент виходить з колонки відразу ж за неактивним білком. Тільки коли між інгібітором і поверхнею носія поміщена довга ніжка (- - 21 А), що утворюється сорбент В здатний сильно пов'язувати р-галак-тозідазу з різних бактеріальних джерел. Елюі-вання ферменту відбувається тільки після заміни буферного розчину.

Вплив рН на зв'язування лактатдегідрогенази м'язи серця свині е-аміногексаноіл - МАВ - сефарозой (а і № - (6-аміногексіл - АМР - сефарозой. Якщо афінний сорбент приготований з зарядженого Аффі-Нанта, то при збільшенні іонної сили розчину аффинность сорбенту по комплементарної йому макромолекулі зменшується.

Такий афінний сорбент з групової специфічністю можна використовувати, наприклад, для очищення ДНК - і РНК-поліиераз, Т4 - полінук-леотідкінази і інших ферментів метаболізму ДНК.

Хроматографія бичачого трипсину на гліцілгліціл - Ь - аргінін - сефарозе. На афінний сорбент, урівноважений даними концентраціями інгібітору (бензілоксікарбоніларгініна) завжди наносився розчин трипсину, що містить інгібітор у відповідній концентрації. Графік залежності Vi від (V - Vt) /[I0 ](Рис. 446) являє собою пряму, що підтверджує справедливість виведеного рівняння. З тангенса кута нахилу і відрізка, що відсікається на осі ординат, отримані /d029 ммоль /л і Уо11 6 мл.

Крім афінного сорбенту на основі агарози, несе барвник Cibacron Blue F3GA (Affi-Gel Blue), фірма випускає ще два сорбенту, що несуть, крім цього барвника, також аніонооб обмінні ( діетіламіноетіл) або катіонообмінні (карбоксиметил) групи: DEAE Affi-Gel Blue і CM Affi-Gel Blue. Перший з них призначений для високоефективної очистки IgG, який зазвичай сорбентом не затримується, в той час як майже всі інші білки сироватки (крім трансферину) залишаються на колонці.

Розведення аффінним сорбентом веде до зменшення пов'язується р, вираженої через концентрації хлориду калію, які необхідні для елюювання ферменту. Ємність сорбенту, виражена в одиницях активності ферменту, сорбованої на 1 мкмоль нуклео-Тіда, зростає при низьких концентраціях нуклеотиду, хоча абсолютна ємність на 1 г матеріалу колонки з розведенням зменшується.

Звичайно, афінний сорбент з високою концентрацією ліганду є небажаним у всіх випадках. На рис. 5.9 показана аффинная хроматографія рецептора ацетилхоліну з електричного органу Torpedo californica[30]на сефарозе, що містить 2 - Ю-3 (рис. 5.9 а) і 0 4 - 10 - 3 моль /л ( Мал. 596) Ин (СН2) 5СО1МН (СН2) з1 (СНЗ) з - Очевидно, що при зменшенні концентрації слабкий, неспецифічний іопообменнік перетворюється в афінний сорбент з високою вибірковістю. Останній був з успіхом застосований для очищення великих кількостей основного а-бунгаротоксінсвязивающего компонента мембрани.

Хоча синтез афінного сорбенту з індивідуальною специфічністю при наявності однієї з продажних активованих матриць і не становить особливих труднощів, він все ж вимагає наявності достатньої кількості очищеного афінного ліганду, що не інактивується в умовах його посадки на матрицю. Проте міцність афінного зв'язування в більшості випадків виявляється достатньою для утримання потрібного речовини на матриці в умовах відмивання з неї всіх супутніх йому домішок.

У числі афінних сорбентів, що випускаються тією ж фірмою, є ще один, призначений також для ковалентного хроматографії. На відміну від всіх попередніх він па кінці досить довгого спейсера несе атом ртуті, охоче зв'язує меркаптосоедіненія.

При синтезі афінного сорбенту (якщо вважати, що всі його компоненти вибрані обгрунтовано) перед експериментатором встають практичні питання кількісних співвідношень, і в першу чергу завдання вибору оптимальної концентрації (щільності просторового розташування) ліганда на матриці. Для цього в описаних вище процедурах посадки лиганда він може варіювати співвідношення кількостей лиганда і матриці, а також умови реакції, зокрема її тривалість. Хоча підбір оптимальної концентрації ліганда в кінці кінців ведеться емпірично, має сенс провести деякий загальний розгляд цього питання, з тим щоб прояснити бодай порядки величин, з яких слід починати такий підбір в кожному конкретному випадку.

Важливою групою афінних сорбентів є іммобілізовані антитіла, або антигени. У першому випадку сорбенти можуть бути використані для специфічного виділення визначених антигенів, або галтенов, зі складних сумішей. У цьому випадку ці сорбенти називають імуносорбент. У другому випадку іммобілізовані антигени сприяють виділенню антитіл з певною специфічністю зі складної суміші антитіл.

Фірма Bio-Rad випускає готові аффінниє сорбенти (типу Affi-Gel) на основі як звичайної, так і хімічно зшитого агарози. У переважній більшості готових афінних сорбентів фірм PL-biochemicals, Sigma і Pierce (крім Agarose-Blue) використовується незшитий 4% - ний гель агарози. Фірми LKB (Швеція) і IBF (Франція) також використовують в якості матриць звичайну і хімічно зшитий агарозу під назвами Ultrogel А і Ultrogel AR відповідно. Вони (особливо IBF) широко використовують змішані матриці типів Ultrogel аса 22 і Ultrogel аса 34 з посадкою лігандів по амідних груп акриламіду. Нагадаємо, що перша цифра в цих найменуваннях означає процентний вміст акрпламіда, а друга - агарози.

Взагалі ретельну промивку афінного сорбенту перед його використанням, а особливо після тривалого зберігання слід передбачити в будь-якому варіанті афінної хроматографії. Це явище небезпечне не зменшенням ємності сорбенту (на частки відсотка), а тим, що перейшли в розчин молекули ліганда можуть виявитися на два-три порядки більш активними щодо зв'язування речовини, ніж іммобілізовані молекули. Це створює ситуацію конкурентної елюції в той момент, коли повинна відбуватися посадка речовини на сорбент. Результатом такої ситуації може виявитися помітне зменшення і навіть повна відсутність затримання речовини на сорбенті. Підтікання лігандів може відбуватися не тільки за рахунок відриву їх ковалентно пов'язаних молекул від матриці, але і в результаті постененной десорбції тих молекул ліганда, що не були відмиті після посадки його на матрицю.

Матеріали для отримання афінних сорбентів наведені структури деяких широко використовуваних спейсеров і показані способи їх закріплення на матриці; наведені також кінцеві реакционноспособниє групи, за допомогою яких ковалентно приєднується ліганд.

Рейсі і Сендквіст готували афінний сорбент, що містить барвник Cibacron Blue F3GA, використавши для цієї мети продажний препарат блакитного декстрану фірми Pharmacia, в якому барвник пов'язаний з декстраном через залишок тріазпнтріхлоріда. BrCN-активованої сефарози вимочували 20 хв в 1 мМ НС1 і промивали 10 разів по 300 мл того ж розчину на скляному фільтрі. потім гель вносили в 50 мл 0 4 М Na2C03 (рН 10), де був попередньо розчинений 1 г блакитного декстрану, перемішували 2 ч при кімнатній температурі, потім відмивали надлишок декстрану на фільтрі і для блокування вільних активних груп імідокарбоната переносили гель в 0 2 М Тріс -HCl (рН 8), де примушували 2 ч з однією зміною буфера.

Просте ycipoitcTBO для десорбції речовини з афінного сорбенту методом електрофорезу[Morgan et al., 1979 ]. Іноді десорбція речовини з афінного сорбенту йде з працею, препарат сильно розбавляється і[имеется опасность его денатурации.

Выход фермента при элюировании растворимым ингибитором. Сплошные линии - V. ч 10, пунктирные - V. о1. Без стадий промывки. Соотношение объемов элюирования сильно влияет на общий выход фермента, который может быть достигнут. На элюировании фермента с аффинного сорбента растворами растворимого ингибитора в различных концентрациях основан наиболее распространенный в настоящее время метод определения констант равновесия выделяемого со связанного ингибитора фермента. Практические примеры применения этого метода детально рассмотрены в гл.

Целью работы было создание нового аффинного сорбента с иммобилизованной л-аминофенилбороновой кислотой ( л - АФБК) на основе широко применяемого в биохимии полиакриламидного геля ( ПААГ) для определения гликолизированного гемоглобина в крови человека.

Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома.

По-видимому, хорошими матрицами для аффинных сорбентов могут служить гидрофильные оксиалкилметакрилатные гели, выпускаемые в США и Чехословакии под названием сфероны. Их гидро-ксильные группы по своим свойствам аналогичны гндроксилам ага-розы. По ним может идти активация бромцианом. Сами матрицы достаточно жестки, химически стойки, не атакуются микроорганизмами.

Недавно фирма Pierce начала выпуск аффинного сорбента для очистки гликопротеидов под названием Glyco-Gel В, в котором борная кислота закреплена непосредственно на матрице 6 % - ной агарозы.

В одноразовом методе сорбции на аффинном сорбенте играет важную роль концентрация фермента в исходном растворе. Такая же зависимость обнаруживается и на рис. 5.3, где приведены теоретические и экспериментальные данные для содержания комплекса фермент - иммобилизованный лиганд на аффинных сорбентах с различной концентрацией лиганда.

Для решения различных задач желательно иметь аффинные сорбенты как с денатурированными ( однонитевыми) ДНК или РНК, так и с нативными двунитевыми молекулами. Условия их химического взаимодействия с матрицей различны - во втором случае часть аминогрупп оснований участвует в образовании водородных связей между комплементарными нитями.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме - методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках.

В ряде случаев необходимо или удобно получать аффинные сорбенты для конкретной цели.

Полная нерастворимость существенна не только для предотвращения потерь аффинного сорбента, но главным образом для предотвращения загрязнений изолируемого вещества растворившимся носителем.

Аффинная хроматография 1251-меченого токсина из Vibrio cholerae на фетуин-агарозе ( а и на ганглиозиддиаминодипропиламино-агарозе ( б. Ганглиозиды, связанные с нерастворимыми носителями, служат аффинными сорбентами холерного токсина. Этот токсин связывает также некоторые гликолротеины, такие, как фетуин и тироглобулин.

Выбрав таким образом буфер, в него переводят как аффинный сорбент, так и вносимый на него препарат. Последнюю операцию легко осуществить диализом или гель-фильтрацией, а иногда и просто разбавлением.

Не удивительно поэтому, что популярность и сфера применения аффинных сорбентов с групповой специфичностью в последние годы быстро увеличиваются, а вместе с ними растет и список таких сорбентов, поставляемых в готовом виде. Нам необходимо познакомиться с торговыми наименованиями, особенностями и областями использования важнейших из них. Иногда эти параметры будут очерчиваться самой сферой применения сорбентов; во всяком случае, их нетрудно найти в каталогах фирм, которые мы упомянем. Рубрикация дальнейшего изложения построена по наименованиям самих лигандов.

В этом разделе мы рассмотрим несколько примеров такого использования аффинных сорбентов с групповой специфичностью, когда элюцию вели раствором субстрата, осуществляя конкурентную десорбцию вещества.

Очистка рецептора для 3 5 3 -трииодтиронина ( Т3 на колонке сефарозы с иммобилизованным гормоном ( текст ILatham et al., 1981 ]. У цій роботі цікаво відзначити підбір оптимального співвідношення кількості афінного сорбенту і білкового розчину. Недолік сорбенту, природно, веде до неповної екстракції рецептора, а надлишок ускладнює конкурентну елюція вільним гормоном і вимагає використання підвищеної концентрації дорогого препарату.

Високомолекулярні аффінниє ліганди зазвичай відкривають більше можливостей для приготування афінних сорбентів. Ряд дуже активних афінних сорбентів отриманий при прямому приєднання білка до нерозчинних носію (численні приклади наведені в гл. Однак в цьому випадку дуже важливим є умова, щоб приєднання білка до нерозчинних носію не приводило до зміни його Натів-ної конформації. Носієм для іммобілізації афінних лігандів служив силікагель, оскільки одержувані аффінниє сорбенти на цьому носії можуть працювати в умовах високого тиску.

Однак не виключена можливість настільки міцною многоточечной посадки білка на афінний сорбент, що його буде важко зняти.

Крім носіїв для зв'язування афінних лігандів ці фірми виробляють також готові аффінниє сорбенти, як це вже зазначалося в розд.

Інші фірми (PL-biochemicals, Bio-Rad, Pierce) випускають аналогічні аффінниє сорбенти на основі поліакриламіду. В цьому випадку не виникає проблем з аніонообмінна властивостями, але використання таких сорбентів для очищення нуклеїнових кислот обмежена меншим розміром пір. Нещодавно було описано отримання фенілборільних сорбентів на основі агарози. Однак, судячи з їх даними, їм не вдалося надійно позбутися неспецифічної сорбції - на цей раз, мабуть, за рахунок вакантних карбоксильних груп вихідного іонообмінника.

У літературі неодноразово описувалися спроби використовувати в якості матриці для афінних сорбентів пористе скло[Wee-tall, Filbert, 1974; Weetall, 1976 ], Однак вони не мали успіху через високу неспецпфнческой адсорбції на склі. Нещодавно було запропоновано використовувати для тієї ж мети великопористий силікагель. Зазначений в попередніх розділах низький рівень неспеціфнческой сорбції на снлікагеле поряд з його ідеальною жорсткістю, добре розробленою технологією приготування дрібнозернистих і крупнопористих гранул відкриває, мабуть, цікаві перспективи для афінної хроматографії.

З зіставлення ВЕТТ можна зробити важливі практичні висновки, а саме знайти афінний сорбент, що характеризується не тільки хорошою связиваемостью, але і кращою вибірковістю. Очевидно, таким чином Олсон та ін. W2w2w26. виявили, що необхідно припинити потік розчину в колонці за кілька годин перед специфічним елюювання. Цей факт можна використовувати для зберігання ферментів, стійкість яких залежить від присутності субстратів або кофакторів.

До речі, слід помститися, що оптимальне з точки зору посадки на афінний сорбент значення рН буфера зовсім не обов'язково має збігатися з рН011т для самої реакції ферментативного каталізу.

Нарешті, якщо такого сорбенту немає, то доводиться вирішувати проблему створення афінного сорбенту з індивідуальною специфічністю: вибирати-ліганд, матрицю, спосіб іммобілізації лиганда на матриці і спосіб елюції. Обгрунтування загального характеру для такого вибору були детально розглянуті вище, але, звичайно, в кожному окремому случае1 можуть виникнути своп специфічні проблеми. Хроматограф-ческуго очищення па афінному сорбенті з індивідуальною специфічністю, як правило, вдається нести в статичному варіанті хро-матографшт.

Тому ми почнемо виклад з короткої характеристики використовуваних в даний час компонентів афінних сорбентів: матриць, лігандів і спейсеров. Одночасно розглянемо способи з'єднання їх між собою, обмежившись лише тими немногімп пз великого числа варіантів, випробуваних і описаних в минулому десятилітті, які витримали перевірку часом. Втім, до них має сенс додати два-три тільки що запропонованих способу, що обіцяють якісь нові переваги. Потім можна буде проаналізувати більш детально параметри і характерні особливості процесу афінної хроматографії і на підставі цього аналізу сформулювати деякі рекомендації щодо практичної постановці експерименту.

На практиці нерідко виникає така ситуація, коли вже готова колонка з аффінним сорбентом виявляється завантаженою лише на малу частку своєї ефективної ємності. Весь препарат в цьому випадку сорбируется в верхньому тонкому шарі сорбенту. Для динамічного хроматографічного фракціонування це добре, але в звичайному варіанті статичної афінної хроматографії така ситуація невигідна вже тим, що в процесі елюції, просуваючись по всій довжині колонки, смуга очищеного речовини буде розширюватися хоча б за рахунок поздовжньої дифузії в елюенті. Проблема легко дозволяється - перед початком елюціі забезпечену адаптером колонку слід перевернути і елюіровать зворотним струмом рідини.

Фірми Pierce і Amicon, крім сорбенту на основі Cibacron Blue, випускають також агарозній аффінниє сорбенти з червоним барвником Procion Red HE3B, специфічна відмінність якого було відзначено вище.

Як уже згадувалося, ковалентний посадка НК на матрицю може виявитися непридатною для створення афінного сорбенту з індивідуальною специфічністю, оскільки багато підстави полі-нуклеотидной ланцюга будуть заблоковані хімічним зв'язком з носієм. З цієї причини широкою популярністю користуються різні методи Нековалентні фіксації НК на матрицях. Історично вони були розроблені значно раніше, але до цих пір не втратили свого значення. Близько половини внесених в розплавлений агар молекул ДНК після його затвердіння виявляються настільки надійно заплутаними в мережу гелю, що не виходять з нього навіть цосле тривалої промивки.

Ми настільки детально розібрали і проілюстрували методику використання BrCN-активованої сефарози, тому що цей варіант приготування афінних сорбентів в даний час користується найбільшою популярністю. Тепер розглянемо (менш детально) способи використання інших готових активованих матриць.

Втім, іноді в препаративних дослідах має сенс примиритися з деякими втратами речовини в інтересах більш повного використання афінного сорбенту, а також з помітним розведенням речовини, якщо є можливість подальшого його концентрування.



Інші публікації на тему:
  • Використання - ліганд
  • Високоефективний сорбент
  • Вплив - сорбент